La cromatografía es un sistema de separación dinámica, porque contínuamente se producen equilibrios entre los componentes de la mezcla a separar y las fases móvil y estacionaria.
La fase estacionaria consiste en partículas, generalmente sólidas, pequeñas y con una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa . En ocasiones es necesario un tratamiento químico de la fase estacionaria para conseguir unas partículas de tamaño y poro adecuados.
La fase móvil puede ser un líquido o un gas, y su función es transportar a los componentes de la mezcla a través del sistema cromatográfico.
En el proceso de separación se produce una competición entre la fase móvil y la fase estacionaria por el componente, y a este proceso se le denomina partición del componente distribuido entre las dos fases. Es decir, se establece un equilibrio entre la concentración del componente presente en la fase móvil y la concentración presente en la fase estacionaria.
El coeficiente de distribución de un componente A se define como:
Donde DA es el coeficiente de distribución del componente A, y [Aest.] y [Amóv.] son respectivamente las concentraciones del componente A en la fase estacionaria y en la fase móvil. El valor del coeficiente de distribución es característico de un componente para una fase estacionaria y una fase móvil determinadas.
Los métodos cromatográficos actuales más modernos monitorizan la salida de los componentes y eluyentes, esto se consigue conectando a la salida del sistema cromatográfico unos aparatos electrónicos, denominados detectores, que detectan pequeñas cantidades de componentes. Si se representan los valores de la concentración de esos componentes frente al tiempo o al volumen de eluyente se obtiene unas curvas Gaussianas denominadas cromatogramas.
Principales parámetros del cromatograma de picos.
1.- Pico del aire.
Es el que corresponde a la detección de una cantidad muy pequeña de aire que entra a la columna cuando se introduce la muestra en el cromatógrafo.
2.- La línea de base.
Es la parte del registro que corresponde a la fase móvil pura (gas portador, ...).
3.- Altura de pico (h).
Es la distancia entre la cima del pico y la línea de base. En el caso de que el vértice sea redondeado se trazan rectas tangentes a los dos puntos de inflexión de las laderas; el punto de corte de las dos rectas determina la altura del pico. (Ver el cuarto pico de la figura anterior).
4.- Anchura del pico (a).
Es la longitud del tramo de la prolongación de la línea de base, comprendida entre las intersecciones con la misma de las laderas del pico o, en su caso, de las líneas tangentes antes mencionadas.
5.- Anchura del pico en la semialtura (ah/2).
Es la distancia paralela a la línea de base, entre las dos laderas del pico, tomada a la mitad de la altura del pico.
6.- Área del pico (S).
Es la comprendida entre el pico y la prolongación de la línea de base. Precisamente a obtener el valor de este parámetro, en los picos del cromatograma, se dedican los dispositivos integradores
Principales parámetros cromatográficos.
1.- Tiempo cero o tiempo de retención del componente inerte (t0).
El tiempo cero (t0) o tiempo muerto (tm), es el tiempo de retención del componente inerte o gas portador.
2.- Tiempo de retención de un componente (tii).
El tiempo de retención (ti o tR) es el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce la mezcla y el instante en que se detecta la señal propia del componente en su máxima intensidad. Los tiempos de retención no son reproducibles, ni siquiera en una misma columna cromatográfica.
3.- Tiempo de retención corregido de un componente (t'i).
Es le tiempo que transcurre entre la aparición de la sañal que corresponde a un componente inerte y a la del componenteconsiderado:
t'i = ti - t0
4.- Tiempo de retención relativa (rip).
Es la razón entre los tiempos de retención corregidos del componente considerado, i, y de otro, p, que se toma como patrón de referencia:
5.- Volumen de retención de un componente (VR).
Es el volumen necesario de fase móvil para transportar el soluto de un extremo a otro del sistema cromatográfico. Se define como:
VR = tR-Fm
donde VR es el volumen de retención expresado como el producto del tiempo de retención de un componente (tR) y el flujo de la fase móvil (Fm). Y el flujo de fase móvil se define como:
donde d es el diámetro interior del soporte utilizado y ε es la porosidad de la fase estacionaria, que suele tener un valor de 0,4 para empaquetamientos sólidos.
6.- Volumen cero o muerto (V0 o Vm).
Es el volumen de eluyente que se consume sin que se detecte ningún componente. Se define igual que el volumen de retención pero el tiempo utilizado es el tiempo muerto:
Vm = tm ⋅ Fm
7.- Volumen de retención verdadero (V'R).
El volumen de retención verdadero de un componente es la diferencia entre el volumen de retención del componente y el volumen muerto.
V'R = VR - Vm
o lo que es lo mismo:
V'R = (tR - t0) ⋅ Fm
8.- Coeficiente de partición o de reparto de un componente (K).
Se define como el cociente entre la concentración de componente presente en la fase estacionaria y la concentreción de componente presente en la fase móvil:
donde Cs y Cm son las concentraciones de componente presente en las fases estacionaria y móvil respectivamente. El valor de K representa el valor de la pendiente de la recta que se obtiene al representar Cs frente a Cm .
9.- Velocidad lineal media a lo largo de una columna (u).
Es la velocidad lineal media a la que se desplazan las moléculas de soluto a lo largo de una columna. Viene dada por la expresión:
donde u es la velocidad lineal media, L es la longitud de la columna y tm es el tiempo muerto.
10.- Factor de selectividad (α).
Es la relación entre los tiempos de retención de dos componentes:
donde α es el factor de selectividad, tRy y tRxson los tiempos de retención de los componentes x e y , y Kx y Ky son los coeficientes de distribución de los componentes. Dependiendo del valor de α se tiene una idea aproximada de como será la separación cromatográfica:
α > 2 se obtiene una mala separación ya que son necesarios periodos muy largos para realizarla.
1< α <2 se obtiene una buena separación cromatográfica.
11.- Factor de capacidad (K').
El factor de capacidad relaciona volúmenes o tiempos de retención de un componente respecto a la fase móvil. Se puede definir como:
Es el cociente entre las probabilidades de encontrar una molécula determinada de soluto en la fase estacionaria o en la fase móvil, o lo que es lo mismo, el cociente entre el tiempo de permanencia de dicha molécula en la fase estacionaria y en la fase móvil.
12.- Eficiencia
Para definir la eficacia se utiliza el concepto de piso teórico, y se define éste como la sección teórico-transversal en la cual se realiza el equilibrio de partición durante el flujo de fase móvil. Cuanto mayor se el número de platos teórico (N) mayor será la eficiencia de la columna.
El número de platos teóricos mide la capacidad de la columna para separar los componentes, no la retención de los mismos. La eficiencia o el número de platos se puede observa directamente a partir del cromatograma, observando la agudeza de los picos.
Donde N es el número de platos teóricos, L es la longitud de la columna, H es la altura de cada plato, t'R es el tiempo corregido de retención de un componente y ai es la anchura del pico cromatográfico. Y:
Si H tiene un valor pequeño, la distancia entre platos es menor y por tanto la eficiencia será mayor. Por el contrario, si H es grande la columna es poco eficiente para separar ese componente ya que sus moléculas estarán muy difundidas.
La velocidad de la fase móvil influye en la eficiencia del sistema cromatográfico, ya que si la velocidad es pequeña los componentes tendrán más tiempo parta que se pueda realizar el equilibrio de reparto, por lo que el número de platos será mayor y la altura de los platos menor.
13.- Resolución (R o Rs).
Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatográfico para dos componentes. Se define como:
Donde Rs es la resolución, tRA y tRB son los tiempos de retención de los componentes A y B, y aA y aB son las anchuras de los picos del cromatograma de los anteriores componentes.
La resolución puede observarse directamente sobre el cromatograma de picos. Se tendrá una buena resolución si los picos no se solapan, y está perfectamente delimitado cada pico, sin que coincida el final de uno con el principio del siguiente.
Si el valor de la resolución está próximo a 0,7 se obtendrá una mala resolución quedando los picos solapados, de forma que se distinguen las crestas, pero no la base, y si el valor de la resolución está próximo a 1,5 se obtendrán unos picos bien delimitados por lo que se obtendrá una buena resolución.
Una pobre resolución es debida principalmente a:
- Hay demasiada muestra en la columna.
- La columna o placa es corta.
- La fase móvil no discrimina entre los componentes.
- La columna es demasiado gruesa.